脂氧合酶（LOX）活性測定試劑盒說明書

                                         微量法100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

LOX廣泛存在于動植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應，導致膜脂過氧化。在生物體的生長發育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。

測定原理：

LOX催化亞油酸氧化，氧化產物在280nm處有特征吸收峰；測定280nm吸光度增加速率，來計算LOX活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

測定：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節波長到280 nm，蒸餾水調零。

2. 在試劑三中加入10mL試劑二（振蕩混勻1min），在30℃水浴中預熱10 min以上。用不完的試劑4℃保存。

3. 對照管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑二，30℃反應30min后，記錄A對照。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑三，30℃反應30min后，記錄A測定。

5. ΔA=A測定-A對照

LOX活性計算：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.01個單位為1個酶活單位。

LOX (U/mg prot) =ΔA×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×100

= 33.33×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.01個單位為1個酶活單位。

LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×100

= 33.33×ΔA÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；V反總：反應體系總體積，200μL=0.2mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質量，g；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應時間，30min。